Criteri di validazione del test BMP secondo Holliger et al. (2016) e loro sviluppi

La pubblicazione di Holliger et al. (2016) rappresenta una sintesi del lavoro di un gruppo internazionale di ricercatori per l’armonizzazione dei test BMP. Definisce gli elementi obbligatori per la validazione: numero minimo di ripetizioni, prova in bianco e controllo positivo (cellulosa), criterio di durata del test, modalità di calcolo del BMP e criteri di scarto del test; inoltre raccomanda, tra l’altro, un rapporto I/S di almeno 2 su base SV e la completa documentazione delle condizioni. I criteri numerici di validazione sono stati successivamente precisati sulla base di due studi interlaboratorio internazionali (Hafner et al. 2020) e inclusi nelle linee guida aggiornate (Holliger et al. 2021) — di seguito descriviamo lo stato attuale. Non si tratta di un atto normativo, ma di un punto di riferimento per laboratori e clienti.

Ambito delle raccomandazioni

I risultati che soddisfano tutti i criteri possono essere definiti "validati"; in caso contrario, il test deve essere ripetuto. Le versioni attuali e liberamente accessibili dei documenti (tra cui il documento 100 "Requirements for measurement and validation of BMP") sono gestite dal gruppo di autori sul sito del DBFZ (dbfz.de/en/BMP).

Criterio di conclusione

Il test si conclude quando la produzione giornaliera di metano da una singola bottiglia per tre giorni consecutivi è inferiore all’1,0% dell’incremento netto cumulato di metano dal substrato (prova con substrato meno media delle prove in bianco). Se le misurazioni vengono effettuate meno frequentemente di una volta al giorno, il test può essere concluso dopo il primo intervallo tra misurazioni (complessivamente almeno 3 giorni) in cui il tasso è sceso al di sotto di questa soglia. In pratica, per la maggior parte dei substrati ciò significa da una dozzina a diverse decine di giorni, mentre per i materiali lignocellulosici può essere più lungo. Alcuni laboratori adottano un tempo fisso, ad esempio 28 o 30 giorni, ma questa scelta può sottostimare il risultato per materiali a lenta degradazione. Nel rapporto si riportano il tempo effettivo e il tasso finale di produzione.

Ripetibilità e scarto dei risultati

La deviazione tra le ripetizioni è un indicatore fondamentale della qualità; per la cellulosa, l’attuale criterio è un RSD non superiore al 6%. Se una bottiglia si discosta chiaramente (perdite, errore di pesata), può essere scartata, ma solo con una motivazione documentata. L’eliminazione arbitraria di risultati "scomodi" distorce l’incertezza. Con un numero ridotto di ripetizioni, l’incertezza è scarsamente stimata.

Reporting

Un rapporto corretto contiene:

1. Descrizione del substrato: origine, preparazione, SS, SV.
2. Inoculo: fonte, SS, SV, pH, degassamento.
3. Rapporto I/S e pesate.
4. Temperatura, durata, metodo di misurazione del gas e formule.
5. Risultati delle prove in bianco e del controllo con cellulosa.
6. Risultati del substrato: media, deviazione, numero di ripetizioni, curve cumulative.
7. Informazioni su eventuali deviazioni dal protocollo.

Dal 2016 al 2021: precisazione dei criteri

Dopo i workshop di Leysin (giugno 2015) e la pubblicazione delle linee guida nel 2016, sono stati condotti due studi interlaboratorio internazionali, e nel 2018 si è tenuto un altro workshop (Freising). Hafner et al. (2020) hanno analizzato oltre 400 valori di BMP provenienti da più di trenta laboratori di quattordici Paesi. La deviazione standard relativa tra i laboratori era compresa tra il 7,5% e il 24%, ma applicando i criteri di validazione scendeva al di sotto dell’8% per tutti e quattro i substrati esaminati. I criteri di validazione raccomandati sono: durata del test (conclusione quando la produzione giornaliera per 3 giorni consecutivi è inferiore all’1% dell’incremento netto cumulato), RSD della cellulosa non superiore al 6% e BMP medio della cellulosa nell’intervallo 340–395 NmL CH₄/g SV. Gli autori hanno evidenziato che il criterio per la cellulosa si è rivelato particolarmente importante. Le linee guida aggiornate sono state presentate nel commento di Holliger et al. (2021, online 2020) e sono gestite come documento aperto "Requirements for measurement and validation of BMP".

Un aspetto separato riguarda il metodo di calcolo della produzione di metano dalle misurazioni (gas secco, condizioni normali, volume dello spazio gassoso) — descritto nei documenti della serie 200 della stessa raccolta di metodi; nel lavoro di Hafner et al. (2020) è stato indicato che gli errori nell’elaborazione e nell’inserimento dei dati erano tra le principali fonti di variabilità.

Esempio di applicazione dei criteri da parte del committente

Si commissiona un test su un insilato e si riceve un risultato di 340 NmL/g SV. Verificare nel rapporto: se è indicato il rapporto I/S (raccomandato ≥ 2), se il BMP medio della cellulosa rientra nell’intervallo 340–395 NmL/g SV con RSD ≤ 6%, il numero di ripetizioni (almeno 3) e il criterio di conclusione. L’assenza di uno qualsiasi di questi elementi non invalida automaticamente il risultato, ma ne riduce l’utilità — chiedere un’integrazione.

Limitazioni

• Le raccomandazioni riguardano test BMP batch (discontinui); non comprendono test continui.
• Alcuni substrati (grassi, materiali fortemente inibitori) richiedono modifiche al protocollo.
• La conformità alle linee guida non elimina la variabilità derivante dall’eterogeneità del campione.

Suggerimenti per i laboratori

1. Introdurre una procedura interna basata sulle linee guida aggiornate.
2. Partecipare a studi interlaboratorio, se disponibili.
3. Archiviare le carte di controllo dei risultati della cellulosa.
4. Aggiornare le procedure dopo la lettura di lavori più recenti.

Come utilizzare le linee guida in un contratto con il laboratorio

Nel commissionare analisi BMP, specificare nell’ordine: protocollo (ad esempio, conforme alle raccomandazioni di Holliger et al. 2016 nella versione aggiornata 2021), numero minimo di ripetizioni, rapporto I/S richiesto, criterio di conclusione, requisito del controllo con cellulosa e formato del rapporto con dati grezzi. Ciò consente successivamente di confrontare i risultati tra diverse serie e laboratori ed evitare controversie sull’interpretazione.

Cosa è cambiato dopo il 2016

Aumenta il numero di studi interlaboratorio e di lavori su calcoli e test con sistemi di misurazione automatici. Le linee guida del 2016 rimangono tuttavia il punto di riferimento più citato. Le raccomandazioni vengono aggiornate sulla base di nuovi studi interlaboratorio, pertanto è utile verificare la versione attuale dei documenti e specificare nei rapporti secondo quale versione è stato eseguito il test.

Esempio di checklist per la ricezione del rapporto

• [ ] Sono indicate le linee guida secondo cui è stato eseguito il test.
• [ ] È riportato il numero di ripetizioni e la deviazione.
• [ ] Sono presentati i risultati della cellulosa e delle prove in bianco.
• [ ] È indicato il rapporto I/S e la temperatura.
• [ ] È spiegato il criterio di conclusione e la durata.
• [ ] Sono specificate le condizioni di riferimento per il volume del gas.
• [ ] Sono allegate le curve cumulative.